Дисклеймер:


Для облегчения больших объёмов клонирования и сохранения генетики без материнского растения, можно использовать такую вещь, как микроклональное размножение с помощью каллусных культур. Думаю, особо это может помочь конопляным бридерам, если среди них внезапно есть такие, кто с методикой не знаком, и хочет облегчить процесс селекции. Разумеется, методика ээфективна и оправдано применима только в том случае, если нужно делать много клонов. Прям МНОГО, а не 30-40.

Каллусные культуры собой представляют массу клеток, потерявших направление развития и похожих на опухоль или кусок перемешанного желе. Из каждой клетки такой культуры может развиться полноценное растение.
Выглядит это всё вот так:


Методика применяется для нескольких целей:
— Крайне быстрое размножение одного генотипа в минимальном объёме с дальнейшей высадкой клонов в грунт.
— Быстрый отбор по некоторым признакам на уровне клеток (в основном на устойчивость к какому-нибудь загрязнению)
— Лёгкое ускорение мутагенеза воздействием излучения или опр. веществ, если необходима некоторая дестабилизация генома исходного образца.

Из сложного, есть необходимые требования:
1) наличие стерильного бокса — в идеале, ламинарного бокса II Класса защиты. Если вы профессионально выводите сорта, но не имеете особо больших площадей для высадки (а кому ещё нужны сотни клонов?), то лучше задушить жабу и потратить 300-400тыщ на ламинарник (не стебусь, если что, вообще не знаю, какой у этих замечательных людей доход) Сложность может возникнуть с тем, что вы физ лицо. Ограничений на продажу нет, по идее, но, возможно, придётся придумать офигительную историю).
Ппростой перчаточный бокс собирается при наличии прямых рук самостоятельно, не особо дорого, и практически ничем не уступает заводскому. В принципе, его можно модифицировать HEPA фильтрами и канальником, что позволит обойти такие ограничения, как невозможность использования внутри нагревательной плитки, но, в любом случае, с ним сложнее работать из -за принципиальной невозможности вносить и выносить предметы после стерилизации рабочего пространства, а также из за некоторой ограниченности в движениях рук, особенно без опыта. Собрать ламинарник самому – тоже теоретически реализуемо, но если у вас есть нормальные познания в динамике воздушных потоков и нехилый опыт DIY.
В ПРИНЦИПЕ микробиологи многие столетия обходились одной горелкой покрупнее, но для такой работы нужно практиковаться довольно долго, чтобы не выносить ничего за пределы стерильной зоны, и всё равно она останется чрезмерно геморройным вариантом для мазохистов.
2) Наличие термостатированного пространства с ~28 градусами (собирается за копейки из любого ящика, пенофола, грелки, термостата за 300р).
3) Наличие минимального набора инструментов и реактивов, из которых самое дорогое – пароварка (а лучше небольшой электрический автоклав) и автоматические мерные пипетки (ага, те, с которыми ученые с умными выражениями лиц раскапывают крашеную воду для фоточек)
4) Умение быстро обучаться довольно осознанно работать над новой задачей, хорошо контролируя порядок действий и движения рук. Если работать даже в стерильном боксе медленно и криво, тряся руками где не нужно – ничего хорошего не выйдет.

Что нужно для того, чтобы сделать каллусную культуру растения и регенерировать из неё кучу кустиков?
А вот:

Замешивание питательной среды:
— Концентрат среды Мурасиге-Скуга (состоит из простых солей и витаминных добавок). Много кто тут сможет замешать её сам, если нет - концентрат стоит довольно дешёво.
— Агар-агар.
— Сахароза.
— Растительные гормоны двух классов (Ауксины и цитокинины) в стерильном концентрированном виде. Тут есть вариации, того, какие именно брать, но достать многие из них при желании - не критично сложно (хоть и сложнее, чем какой-нибудь спирт). Хватает на дохрена, хранятся строго в морозилке!

Их этих компонентов (без добавления гормонов, они понадобятся позже) готовятся питательные среды. Всё замешивается в дистиллят, смесь нагревается при перемешивании, разливается в ёмкости и стерилизуется высокой температурой в пароварке/автоклаве (120 градусов, 15-20 минут). После остывания среда хранится в холодильнике.

Разливание питательной среды:
Топим среду на небольшой мощности на плитке, когда она растворилась даём остыть чтоб рука терпела, закапываем туда определённые дозы заранее разведённых в дистилляте гормонов, разливаем над горелкой в пустые банки по 1-2см.

Подготовка семян:
Можно использовать любую ткань растения, но изначально легче всего работать с семенами, особенно в нелабораторных условиях, т.к. растительный материал обязан также быть стерильным, а с семенами этого добиться проще. Для начала их нужно промыть с антибактериальным мылом, затем вымочить в растворе спирта 70% час с небольшим активно перетрясая, выдержать 10-15 минут в перекиси водорода 10%, снова поместить в спирт (не тот же, свежий) до высадки.
На будущее – 70% спирт всё что угодно стерилизует лучше, чем 95%, как бы нелогично это не звучало. 95% - лучше сушит.

Высадка семян:
Когда среда с гормонами в банках с застыла, пинцетом раскидываем семена по несколько штук в банку, слегка вдавливая в среду, закрываем, ставим банки в 28 градусов.
Спустя какое-то время у нас появляется каллусная культура. Света ей не требуется, но для активного роста важна постоянная температура. Также следует следить за тем, чтобы каллусом не выедалась полностью питательная среда, и регулярно пересаживать/размножать на такую же, свежую. Важно: слишком долго (не неделю-две, а прям вот дольше, не помню насколько) находящиеся в состоянии каллуса клетки приобретают свойство гармононезависимости, и из них в дальнейшем не удаётся регенерировать растения, так что не стоит затягивать с получением, собственно, клонов.

Клоны получаются путём переноса каллуса на среду с соотношением гормонов, которое стимулирует развитие побегов. При этом из каллуса начинает активно лезть куча небольших побегов. Эти побеги срезаются, и высаживаются на среду для укоренения.
Затем их высаживают в небольшие горшки под парник. Важно ни капли не давать таким побегам пересыхать, иначе всё поляжет и/или побелеет. Для привыкания к новым условиям им требуется время.

Lyser25,
За гормоны расскажи побольше... А самое главное где их достать?

темы насчёт каллуса уже были

Не скажу за MJ, а вот орхидеи именно так и размножают семенами.
Опыляют цветок, получается такая "сумка" с семнами,



дальше, стерильная среда, агар-агар, банки/бутылки, итд
Является ли это каллусной культурой (неорганизованная пролиферирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток)
скорее всего да, хотя бы частично.



В youtube есть много инструкций как и что.
Интересное занятие, только долгая тягомотина.

есть несколько магазинов торгующих готовой средой Мурасиге-Скуга и В5. Есть и в порошках готовые, останется только разбавить и стерилизовать. Можно китайские купить, но там хз что намешано. Гормоны хорошие и недорогие есть у ребят greenaglolab

Сложно купить готовые, вернее получить, Мурасиге-Скуга - Условия хранения: от 2 до 8°С
Но есть в порошке на ebay
Правда требует дополнительные компоненты для приготовления рабочей питательной среды

Есть и готовые Среда с сахарозой, BA, NAA и агар

Питательные среды, прям разорится можно

Есть же тема уже, зачем новую создавать?

fpost2706814.html#p2706814

Что касается каллуса и работы с меристем, это уже более продвинутые техники, требующие серьезного подхода. уже то, что эта работа предусматривает несколько переносов на разные среды, говорит о необходимости иметь и оборудование и знания и опыт.
Меристем конечно интересен в плане сохранения и обновления генетического материала. Черенки, которые мы обычно берем от маточного куста имеют на себе, кроме всего прочего, и вирусы и патогены и ее незнамо что. Поэтому, если стоит цель обновить материнское растение, получить его в более чистом виде, то меристем вполне для этого подойдет.

Зачем это рядовому гроверу? По большому счету незачем, если он и так вполне доволен результатом.

Знание базовых вещей все равно не будет лишним. Например, многие из нас имеют в запасах большое количество старых семян которые лежат в холодильниках уже десяток - другой лет. Когда семян одного сорта много, то можно обойтись и стандартными способами проращивания, а вот когда их всего несколько штучек то тут более предпочтительно стартовать их в стерильной среде чтобы получить максимум возможного результата.
Или, вы хотите получить черенкованием клонов от одного кустика или поделиться с кем то черенком, к примеру безопасно выслать его по почте итп...отрезаете несколько маленьких кусочков стебля с одной - двумя почками роста, стерилизуете их, помещаете на среду и вперед.
В общем тема обширная, имеет свои ответвления и интересна в плане ее развития применительно к каннабису




с тех пор много чего поменялось. Да и тема та давно прокисла а в этой есть какая то перспектива.

Хотел как то настроить микроскоп чтобы было видно что делаю, как отделяю меристему итп..но у меня дешевенький китаец, которого мне в общем то хватает, но снять видео с него я не могу. Может позже что то получится.
Для чего это вообще нужно...как уже писали выше - для воспроизводства. Но для домашнего гровера важно скорее сохранить генетику нежели штамповать тысячи клонов. Преимущества размножения инвитро в том что:
1. Растение очищается от патогенов и вирусов. (если растить меристему)
2. Растение сохраняется в очень небольшом объеме поэтому для содержания нескольких десятков мамок уже не требуется большая площадь, при надобности просто укореняем черенок и проделываем с ним все что необходимо. К сожалению метода консервации меристем я не знаю, но говорят что есть...видимо секрет.

Использую G-b5 + MT. По ауксинам и сахарам тут уже дело вкуса.....какого то универсального рецепта у меня нет, для меристемы одно, для черенка будет немножко другое, так что здесь простор для фантазии большой..
Компоненты среды покупаю на ebay в Германии, готовлю, разливаю в банки для анализов и в микроволновке грею до начала закипания. грею 2 раза с перерывом в полчаса. Когда среда остыла можно переносить меристему или стерилизованый черенок.

Добрался до способа сохранения черенка до нужного момента. Оказывается уже в 60х годах эта техника активно использовалась, не говоря уже о текущем моменте. Это синтетические семена, представляющие собой стерилизованные почки роста закрытые в шарике из питательной среды. Собираюсь попробовать как только будет из чего пробовать. Интересно конечно.

Из за ограничений не могу купить ингредиент для синтетических семян. Надеюсь это не продлится долго. Ну а пока в виде эксперимента, попробую клонировать автоцветущий феминизированный сорт AB#1
Для начала черенки нужно стерилизовать. Процедура стандартная
Хлор - вода - этанол - вода.



Затем отсекаю все что не нужно и помещаю на среду

older, ... Вариант с рассылкой понравился... А это ведь тема... Беспалевно переслать материал

older, Спасибо! Очень интересно. А можно подробней сколько такой черенок может хранится в питательной среде и при каких условиях? уже сам нашел и прочитал.

older,

Это что значит?... Можно черенки в консервную банку закатать?

aist666, насколько я узнал, в прохладной среде такая синтетическая семка совершенно нормально живёт до четырех месяцев а то и больше. То есть теоретически берём пробирку с синт. семенами. Охлаждаем, пакуем и отправляем почтой. Внешне там просто кусочек зелёной куйни без листьев ИТП так что идентифицировать это визуально без химанализа невозможно..
Что семка из себя представляет...представьте себе икринку, шарик в котором запечатана почка роста. Эта семечка впоследствии высаживается на стерильный субстрат и выращивается как обычно. Но тут надо пробовать..

Отдельно брал одну только почку роста с зачатками листьев. Сегодня заметил что она начала вегетировать. Фотку пытался сделать раз 39 но с резкостью проблема.



Короче эта пика на макушке и есть тот прогресс о котором я говорю. То есть пока движемся в верном направлении. И главное что это всё делается в домашних условиях.

older, а может эта субстанция стать основой для формирования корневой системы... Конечно для этого есть корневин, к примеру. И все таки. И ещё, этаже субстанция может работать как...промежуточная "ткань" для срастания прививочного черенка...
Я слышал что поивился тип пластика способный менять свою фору от температуры человеческого тела... Если из такого пластика сделать термоусадочную трубку, запихать туда этот гель-субстанцию, потом в ауте взять чикнуть у дикухи ветку или несколько веток, и вместо них черенки от пантовой мамки, через этот гель и термоусадку нового поколения... Перед этим протиреть спиртом... Или перекисью

aist666,
Насчёт укоренения.
Для формирования корневой системы нужны гормоны. Это IAA, IBA, и их водорастворимые соли IAa-K, IBA-K. Пропорции для каннабиса конкретно, мне на данный момент не известны. Я имею в виду эффективные количества этих веществ так как перебарщивать тоже нельзя.
Есть также протокол в котором используется синтетический цитокинин и он вроде как достаточен для всех стадий культуры от ткани и формирования каллуса до уже полноценного растения. Я это видел но эти люди не делятся и не продают ничего из рецептур и протоколов, так что я чисто по книжному пока делаю.

Теперь по поводу прививки. Нафига так заморачиваться, просто привил да и всё. Конопля же прививается на ура и безо всяких извращений. Термоусадку обычную можно заюзать, зеленого цвета чтобы закрепить место прививки.

Гляньте кого я нашел.
https://www.instagram.com/invitro_biotechnology_/